Bioseguridad

La esterilidad puede definirse como la ausencia de microorganismos viables.

Las pruebas de esterilidad de productos farmacéuticos estériles son una parte importante de la microbiología GMP, y se utilizan para garantizar que las terapias farmacéuticas y biofarmacéuticas son realmente estériles y seguras para el uso humano.

Las pruebas clásicas de esterilidad pueden no ser adecuadas para todos los productos debido al tiempo de incubación de 14 días.

Los métodos rápidos son más adecuados para productos basados en células (por ejemplo, células modificadas genéticamente ex vivo administradas frescas o con un tiempo de retención limitado entre la formulación final y la administración al paciente) teniendo en cuenta la ventaja de acortar los plazos de liberación para pacientes sin soluciones terapéuticas alternativas.

Pruebas realizadas:

• Prueba de esterilidad clásica (EP 2.6.1/USP <71>)
• Prueba de esterilidad rápida (EP 2.6.27)

Los productos farmacéuticos administrados por vía parenteral deben estar libres de contaminación pirogénica (que provoque fiebre), ya que estas sustancias pueden inducir una respuesta sistémica potencialmente mortal del sistema inmunitario innato del paciente. Un medicamento estéril puede ser pirogénico, por lo que se necesitan pruebas específicas para evaluar este parámetro.

Las pruebas in vitro más comunes para la detección de pirogenicidad se conocen como Prueba de endotoxina bacteriana (BET) / Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), ya que la endotoxina, en particular de bacterias gramnegativas, es la causa más común de reacciones tóxicas resultantes de la contaminación con pirógenos.

Sin embargo, los pirógenos no endotoxínicos (NEP) son indetectables mediante el ensayo de endotoxinas bacterianas, por lo que existe el riesgo de pasar por alto una contaminación por NEP.

En los últimos años se ha desarrollado una prueba alternativa de pirógenos in vitro, la prueba de activación de monocitos (MAT), para detectar y cuantificar las contaminaciones por endotoxinas y NEP.

Varias combinaciones de proteínas y/o componentes de la formulación que componen los productos farmacéuticos biológicos estériles acabados pueden producir una baja recuperación de endotoxinas (LER), generando el fracaso en la detección de endotoxinas en algunos productos farmacéuticos biológicos estériles acabados utilizando BET. La Parenteral Drug Association (PDA) publicó el Informe Técnico n.º 82 sobre LER, en el que se presentan directrices para desarrollar el diseño del estudio de tiempo de retención de LER y se proporcionan estrategias para mitigar la LER. Los estudios LER han sido solicitados desde 2013 por la FDA en la presentación de BLA (Solicitud de Licencia Biológica).

Pruebas realizadas:

• Prueba de endotoxinas bacterianas (2.6.14/USP <85>/JP); Método D (EP): Cinética cromogénica (método cuantitativo)
• Método A (EP): Método del coágulo de gel (prueba límite)Prueba de recuperación de endotoxinas bajas
• Prueba de activación de monocitos EP 2.6.30, Método A (método cuantitativo)

Las especies de micoplasma son bacterias que pueden infectar los cultivos celulares.

La contaminación por micoplasma de las líneas celulares utilizadas para elaborar productos biofarmacéuticos puede alterar el crecimiento y el metabolismo celulares y provocar cambios en la expresión génica, lo que se traduce en una disminución de la cantidad y la calidad del producto y supone una amenaza potencial para el paciente.
Por estas razones, las agencias reguladoras de todo el mundo exigen que los productos biotecnológicos producidos en sustratos celulares se sometan a pruebas para garantizar la ausencia de contaminación por micoplasma.

Las pruebas convencionales de micoplasma, según EP 2.6.7 y USP <63>, son el método de cultivo y el método de cultivo celular indicador. En función de los diferentes productos, es necesario un único método o ambos.

Actualmente se dispone de varios métodos basados en la técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) para reducir drásticamente el tiempo de respuesta, especialmente para productos biofarmacéuticos que tienen vidas medias cortas.

La NAT puede utilizarse para la detección de micoplasmas mediante la amplificación de ácidos nucleicos extraídos de una muestra de ensayo con cebadores específicos que revelan la presencia del ácido nucleico diana. La NAT indica la presencia de una secuencia particular de ácido nucleico y no necesariamente la presencia de micoplasmas viables.

Pruebas realizadas:

• Método de cultivo
• Método de cultivo de células indicadoras
• Método NAT: PCR en tiempo real
• Método NAT: PCR en gel de agarosa

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define los agentes adventicios como microorganismos que pueden haberse introducido involuntariamente en el proceso de fabricación de un medicamento biológico. Entre la amplia gama de agentes adventicios, los virus son una de las fuentes más comunes de contaminación.

Los ensayos de virus adventicios se realizan como parte de las pruebas de materias primas, caracterización de líneas celulares y pruebas de liberación de lotes de productos biológicos como anticuerpos monoclonales, vectores de terapia génica, proteínas recombinantes y vacunas.

Se pueden realizar diferentes pruebas para detectar virus adventicios en función de la finalidad específica del ensayo y de la técnica que se pueda aplicar.

Principalmente, los virus adventicios pueden detectarse mediante:

• la técnica PCR, tanto cualitativa como cuantitativa
• ensayos basados en células

Pruebas realizadas:

• Pruebas PCR cualitativas/cuantitativas para detectar virus adventicios y endógenos
  • virus humanos
  • virus respiratorios
  • virus porcinos
  • virus bovinos
  • otras PCR de dianas específicas.
• Ensayos de detección de retrovirus
• Ensayos basados en células: efecto citopático, ensayo de hemaglutinación (HA-test), ensayo de hemadsorción (HAD-test), ensayo de placa, inmunofluorescencia
• Tinción (IFA)

La identificación microbiana es la caracterización de un determinado microorganismo mediante un método de ensayo apropiado capaz de devolver el nombre de la especie analizada.

Es una herramienta esencial para las empresas farmacéuticas que necesitan identificar las fuentes y características de las contaminaciones microbianas en los productos, el medio ambiente, el agua, etc.

La secuenciación del ADN se considera la técnica de identificación más avanzada que proporciona resultados precisos y que está/ha sustituido rápidamente a los métodos bioquímicos en la industria farmacéutica, impulsada también por las crecientes exigencias de las empresas farmacéuticas y las autoridades competentes.

La identificación microbiana abarca bacterias, levaduras y hongos.

Pruebas realizadas:

• Identificación de bacterias (análisis comparativo de secuenciación génica casi completa del ADNr 16S, kit de PCR y secuenciación del ADNr 16S MicroSeq 500)
• Identificación de hongos y levaduras (kit de secuenciación y PCR MicroSeq D2LSU)

Secuenciación de ADN y ARN por el método Sanger para evaluar la estabilidad genética de las muestras, con la posibilidad de partir de productos de PCR, ADN de muestra o MCB/WCB.

El ADN residual, o ADN de la célula huésped, puede ser un contaminante presente en los productos biológicos que se purifican conjuntamente con las sustancias farmacológicas.

Pruebas realizadas:

• Detección de ADN genómico de múltiples especies (E. coli, ratón, células CHO, levadura (Pichia), canino y células Vero).
• Detección de ADN genómico humano

PE 2.7.5. Ensayo de heparina

Pruebas de enumeración microbiana (PE 2.6.12)

Pruebas de detección de microorganismos específicos (PE 2.6.13)